单碱基多态性和蛋白质的检测新方法研究(59页).rar

摘要
基因片段的变异与基因疾病的产生有密切的关系，其中单碱基多态性是最常
见的遗传变异。单碱基多态性的精确、灵敏和特异性检测已经成为全社会关注的
问题，并且有望在DNA诊断中起到至关重要的作用。蛋白质是一类重要的生物标
志物，它的分析检测在生物学、医学诊断等领域具有非常重要的意义。本论文致
力于单碱基多态性和蛋白质的检测新方法研究，完成了三项工作，实现了对目标
物的快速、灵敏、准确检测。主要内容如下：
1.利用适配子-血红素的复合物能够模拟辣根过氧化酶的生物活性，催化鲁米
诺和双氧水的化学发光反应的特性，提出了一种基于连接酶检测反应和等温扩增
反应的化学发光检测方法，用于单碱基多态性的检测【第2章】。对于完全匹配的
杂交体,通过连接酶检测反应，产生大量的探针连接产物，但对于单碱基错配的杂
交体，连接酶不起连接作用。连接产物由于在DNA聚合酶和限制性内切酶的共同
作用下，发生等温扩增反应，扩增出大量的血红素的适配子，适配子与血红素结
合，形成的复合物催化鲁米诺和双氧水的化学反应。在一定范围内，化学发光的
强度与目标链浓度成正比，从而实现单碱基多态性的定量检测，检测下限达到1 pM.
我们用该方法对细胞色素P450酶系中的异喹胍羟化酶的单碱基多态性
(CYP2D6*10)进行了检测，使突变型和野生型基因DNA得到了很好的区分。
2.基于类似的原理，将上述方法改进发展，实现了单碱基多态性更灵敏、更快
速的分析检测【第3章】。分析过程包括两个并行合作的等温扩增反应，第一步等
温扩增产生的核酸链可以作为第二步等温扩增的引物，引发第二步等温扩增，产
生了大量的血红素的适配子，通过检测适配子-血红素复合物催化产生的化学发光
的强度，定性定量检测单碱基多态性。
3.适配子传感技术与临近杂交、体外转录相结合，建立了一种新的蛋白质荧光
检测方法【第4章】。当溶液中没有凝血酶时，由于两条探针尾端的互补序列很短，
所形成的杂交体的熔链温度很低，在反应温度下，极不稳定。然而当溶液中存在
凝血酶的时候，适配子探针与凝血酶特异性结合，拉近了探针间的距离，使得探
针能够杂交，聚合酶延伸产生启动序列，进而转录出孔雀石绿的适配子，适配子
与孔雀石绿结合，使其荧光增强，从而实现对凝血酶的检测。
关键词：生物传感技术；适配子传感技术；化学发光；临近杂交;体外转录；
单碱基多态性；蛋白质




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