高效天冬氨酸转氨酶基因工程菌构建与表达的研究(72页).rar

摘要
L-苯丙氨酸是人体必须的八种氨基酸之一，广泛应用于医药，化工等行业。
我国Ｌ－苯丙氨酸年需求量在2000吨以上,虽然国内也有小规模生产的报道，但
主要依赖进口
[1,2]
。因此研究、开发高效的Ｌ－苯丙氨酸的生产技术具有重要的
现实意义。
在众多苯丙氨酸的工业化工艺路线中，将化学合成法和生物酶法催化相结
合，由海因合成亚苄基海因再水解为苯丙酮酸，再以苯丙酮酸为底物，经生物转
氨催化制备L-苯丙氨酸的路线因其工艺路线简单，方法稳定而备受关注。
[3]
南京
工业大学制药与生命科学学院经过多年研究，已经从根本上解决了原料苯丙酮酸
的生产问题，使得该苯丙氨酸合成工艺路线的突破成为可能
[4]
，而催化苯丙酮酸
（PPA）制备L-苯丙氨酸的高产生产菌的选育则是该工艺路线急需突破的另一瓶颈
[5]
。本研究利用基因工程的方法构建高效表达苯丙氨酸转氨酶的生物工程菌并对
外源基因表达的调控进行研究。
为了获得具有高活力天冬氨酸转氨酶的基因工程菌，本研究设计AspC引物
在大肠杆菌中获取了编码天冬氨酸转氨酶的基因aspC的ORF。将其与本室构建
的组成型启动子P121连接后分别插入至pUC19，pSE380，pet22b三个不同的载
体中，从而构建出三种组成型表达质粒：pUC/aspC；pET/aspC；pSE/aspC，并
分别转化至不同的宿主菌中，其中以Escherichia.coli BL21为宿主的工程菌具
有较快的生长速度和较高的酶活。通过对重组质粒拷贝数，生长曲线及产酶情况
的比较，结果表明，BL21-pET/aspC因其所含组成型质粒拷贝数略低于其他两株
菌，外源基因表达量相对较低，对宿主的压力较小，发酵后可获得较高的生物量，
另外单位细胞的蛋白表达量相对较低，有利于蛋白的正确折叠，减少了包涵体的
产生，从而发酵后重组菌总酶量表达高于其他两种重组子。而且本实验新构建的
三种重组菌经检测均具有良好的辅酶PLP的再生体系，使该法制备L-Phe更具实
际应用价值。
本文对筛选出的重组菌BL21/pET-aspC做了摇瓶发酵条件优化，探讨了不同培养工艺条件下重组菌的质粒稳定性问题，获得以玉米浆为主要营养物的廉价而
高效的营养体系，相对出发培养基LB，酶比活力由80左右提高至180 u/mL多，
目的基因表达量大幅度提高，同时又大大降低了发酵成本。以优化后培养基发酵
重组菌，直接以发酵液为酶液转化底物天冬氨酸和苯丙酮酸制备L-苯丙氨酸。
以天冬氨酸和苯丙酮酸（30g/L）为底物，生成L-苯丙氨酸25.53g/L，转化率高
达85.1％。该体系无需IPTG诱导，体现了良好的产业化前景。
关键词：天冬氨酸转氨酶；L－苯丙氨酸；苯丙酮酸




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