喜树发根培养及培养基中次生代谢产物的研究.doc
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喜树发根培养及培养基中次生代谢产物的研究,本文共30页。、2.1万余字摘要喜树毛状根培养不仅能生产喜树碱，而且可把二次代谢物如喜树碱等分泌至培养基中，利用现代生物技术与现代分离技术综合开发喜树和喜树碱，这是喜树资源的保护开发的新突破。本论文先对喜树发根进行培养，然后使用氯仿提取喜树培养基中喜树碱等有效成分，并用hplc检测法检测其有效成分，检测发现喜树分泌在培...
内容介绍
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本文共30页。、2.1万余字
摘 要
喜树毛状根培养不仅能生产喜树碱，而且可把二次代谢物如喜树碱等分泌至培养基中，利用现代生物技术与现代分离技术综合开发喜树和喜树碱，这是喜树资源的保护开发的新突破。本论文先对喜树发根进行培养，然后使用氯仿提取喜树培养基中喜树碱等有效成分，并用HPLC检测法检测其有效成分，检测发现喜树分泌在培养基中的次生代谢产物除了喜树碱、羟基喜树碱、白桦脂酸外，还含有其他有效成分。另外的氯仿提取法与树脂吸附法对加了标液的空白培养基进行提取的对比实验，证明了树脂富集培养基中微量的喜树碱的效果比氯仿提取的效果好，而且富集到的种类要比氯仿提取的多。这个实验为以后用树脂作为吸附材料，从喜树发根体系的培养基中富集喜树碱做了很好的铺垫。
关键词：喜树碱 喜树发根培养基 氯仿提取 HPLC检测
目 录
1 绪论 1
1.1 前言 1
1.2 喜树生物学特性与药用价值 2
1.2.1 生物学特征 2
1.2.2 药用价值 2
1.3 扩大喜树碱药源途径的研究 3
1.3.1 组织培养及喜树细胞悬浮培养 3
1.3.2 利用毛状根培养技术生产喜树碱 4
1.3.2.1 发根农杆菌的特性 4
1.3.2.2 毛状根的转化方法、培养和鉴定 5
1.4 光照对喜树培养的影响 5
1.4.1 光照对毛状根生长及其次生代谢产物合成因素的影响 5
1.4.2 光照对喜树愈合组织生理及喜树碱合成的影响 6
1.4.3 光强对喜树幼苗叶片次生代谢产物喜树碱的影响 6
1.5 大孔吸附树脂吸附原理 6
1.6 喜树碱的富集与检测 7
1.7 本课题研究的内容 7
2. 喜树发根培养 7
2.1 喜树枝条不同组织及基本培养基的筛选 7
2.2 不同种类、浓度的植物生长调节剂对喜树茎段腋芽、不定根的诱导 9
2.3 发根农杆菌感染喜树茎的培养 10
3 喜树发根培养基中次生代谢产物喜树碱提取 11
3.1 试验材料与仪器 11
3.1.1 试验材料 11
3.1.2 试验仪器 11
3.1.3 色谱条件 11
3.2 试验方法 11
3.2.1 标液的配置 11
3.2.2 喜树培养基中喜树碱等有效成分富集试验 12
4 HPLC法检测喜树碱等喜树有效成分 12
4.1 标准曲线的测定 12
4.2 空白养基中喜树碱的抽滤氯仿萃取与树脂吸附的对比 15
4.3 培养基中富集喜树碱等有效成分的HPLC检测结果 15
4.3.1 培养基中培养产物喜树碱等有效成分的检测 15
4.3.2 喜树培养基经抽滤处理后滤渣与滤液中喜树碱含量的对比 16
4.3.3 喜树培养基中喜树碱等有效成分的检测结果 17
5 总结与讨论 20
5.1 结论 20
5.2 存在问题与展望 20
5.2.1 存在的问题 20
5.2.2 展望 21
参 考 文 献 22
英 文 摘 要 24
致 谢 25
1 绪论
1.1 前言
喜树碱是一种从喜树中分离出来具有抗癌活性的生物碱。喜树广泛分布于亚洲，在我国分布尤其多，为中国特有树种。我国的野生喜树可以作为药用的叶片和种子资源总量为2158.09t和134.99t。由于喜树主要分布在人为活动区，一直是毁林开田的砍伐对象，喜树的野生种群已相当少见。在我国，野生资源已经处于濒危状态，在某些地方已经绝迹，现存的少量的野生资源也存在灭绝的危险，而且喜树碱仍不能化学合成，所以喜树资源仍是喜树碱及其类似物的唯一来源。
面对野生喜树资源已经处于濒危，且喜树碱仍不能化学合成的残酷现状，利用现代生物技术与现代分离技术综合开发喜树和喜树碱是喜树资源的保护开发的新突破。Sakato、Arjon J等人的工作表明，通过细胞培养物中目标产物含量很小，因此至今未有实际生产的应用。发根农杆菌诱导出的毛状亘具有生长迅速、激素自养、生长条件简单、次生代谢产物含量高且稳定以及分化程度高、不易变异等特点，此外尚可以从毛状根培养物中寻找新的化合物。因此毛状根技术被认为是一条利用生物技术生产代谢新的有效途径。国内外学者在这方面。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。
参 考 文 献
[1]中国树木志编委会. 中国主要树种造林技术[M] . 北京:农业出版社，1976.
[2]杨荣和,耿礼祥,等. 贵州省喜树资源初步调查[J ] . 贵州林业科技,2001，29 (1)：32 - 36.
[3]杨学义,朱立,孙超. 喜树资源及其开发利用[J].资源与环境，2007，3(7)：618-619
[4]冯建灿,张玉洁,等. 喜树及喜树碱开发利用进展[J ] . 林业科学，2000，36 (5)：100 - 108.
[5]王洋，戴绍军，阎秀峰. 光强对喜树幼苗叶片次生代谢产物喜树碱的影响[N]. 生态学报，
2004，24（6）：1118-1122.
[6]顾青，朱睦元. 光照对喜树愈合组织生理及喜树碱合成的影响[N].浙江林学院学报，
2006，23(3)：280～28
[7]刘展眉，崔英德，宾淑英. 喜树及喜树碱研究中的生物技术应用[J].广东化工，2006，（6）：67-70.
[8]刘高，饶力群 ，杨华.影响毛状根生长及其次生代谢产物合成因素的研究进展[J].生物技术通讯，2007，5（1）：888-890
[9]孙君明，丁安林，沈黎明．光照对大豆幼苗组织中异黄酮含量和分布的影响[J]．植物学报，1998,40(1)：1015
[10] Liu CZ，Guo C，Wang YC．et a1．Effect of light irradiation on hairy root growth and artemisinin biosynthesis of Artemisia annual [J]．Process Biochem，2002，38：58l
[11]杨睿，付春祥，金治平，等．不同理化因子对雪莲毛状根生长和总黄酮生物合成的影响．生物工程学报，2005，21(21)：234
[12]杨荣和，耿礼洋，龙秀琴，等．贵州省喜树资源初步调查[J]．贵州林业科技，2001，29(1)：32236．
[13]Griffith EC，Niwayama S，Ramsay CA，Chang YH．Molecular recognition of angiogenesis inhibitors fumagillin and ovalicin by methionine aminopeptidase2[J]．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998,195(26)：15183-15188．
[14]Sakato．K，Misawa M．Efects of chemical and Physical conditions on growth of Camptotheca acuminata cell cultures，Agr. Biol. Chem．，1974，38：491-497．
[15]Sakato I.，Tanaka H.，et a1．Isolation and identification of camptothecin from cells of Camptotheca acuminata suspension cultures．Agr.Bio1．Chem．，1974，38：2l7-2l8．
[16]Arjon．J．van Hengel M．P．Harkes et a1．，Characterization of callus formation and camptothecin Production by cell lines of Can Ptothecaacuina, Plant cell，Tissure and Oran Culture，1992．28：11-18．
[17]Sakato，K．，Tanaka.H.，Mukai，N．，Misawa, M．，1974．Isolation and identification of camptothecin from cells of Camptotheca acuminata suspension cultures．Agric．Bio1．Chem．38，217-218．
[18]Wiedenfeld，H．Furmanowa, M．Roeder,E．Guzewska, J．Gustowski，W，1997．Camptothecin and 10-hydroxycamptothecin in callus and plantlets of Camptotheca acuminata．Plant Cell Tiss．Org．Cult．49,213-2l8．
[19]A.K.Jain&C．L.Nessler．Clonal Propagation of Calptotheca acuminata through shoot bud culture．Plant Cel1.Tiss．And Org．Culture. 1996．44：229-233．
[20]Ciddi，V．，Shuler，M.L.，2000.Camptothecin from callus cultures of Nothapodytes foetida．Biotechno1.Lett.22,129-132．
[21]Fulzele，D.P.，Satdive，R.K，Pol，B.B 2001．Growth and production of camptothecin by cell suspension cultures of Nothapodytes foetida．Planta Med．67,15-l52．
[22]Tanaka N，Hayakawa M，Mano Y, et al，1985．Infection of turnip and radish storage roots with Agrobacterium rhizogenes[J]．Plant Cell Report,4：74-77．
[23]Zheng ZR，Peng JS，Liu D, et al，1997．The mass culture of the hairy roots of Astragalus membranaceus[J]．Plant Physiol Commun，32(2)：l33-134．
[24]Zhou YQ，Zhang FG,Yuan BJ，1996．Review of studies on obtaining transgenic plants by Agrohacterium rhizogenes mediated gene transfer system[J]．Hereditas，18(4)：45．
[25]Shanks JV,BhadraR,Rijhwani S，et a1．Biotechnology and Bioengineering．1998，58：333
[26]Liu SN，Sun TE，Li GB，1998．Transformation of Ginkgo hairy root and establishmentofits suspension culture [J]．J Wuhan Univ(Natural Science Edition)(武汉大学学报-自然科学版)．1998, 44(2)：l53-156．
[27]Wiedellfeld Helmut，Meroslawa Furmanowa,Erhard Roeder,Joanna Gu．Plant Cell Tissue and Organ Culture.1997, 49(3)：213-2l8．
摘 要
喜树毛状根培养不仅能生产喜树碱，而且可把二次代谢物如喜树碱等分泌至培养基中，利用现代生物技术与现代分离技术综合开发喜树和喜树碱，这是喜树资源的保护开发的新突破。本论文先对喜树发根进行培养，然后使用氯仿提取喜树培养基中喜树碱等有效成分，并用HPLC检测法检测其有效成分，检测发现喜树分泌在培养基中的次生代谢产物除了喜树碱、羟基喜树碱、白桦脂酸外，还含有其他有效成分。另外的氯仿提取法与树脂吸附法对加了标液的空白培养基进行提取的对比实验，证明了树脂富集培养基中微量的喜树碱的效果比氯仿提取的效果好，而且富集到的种类要比氯仿提取的多。这个实验为以后用树脂作为吸附材料，从喜树发根体系的培养基中富集喜树碱做了很好的铺垫。
关键词：喜树碱 喜树发根培养基 氯仿提取 HPLC检测
目 录
1 绪论 1
1.1 前言 1
1.2 喜树生物学特性与药用价值 2
1.2.1 生物学特征 2
1.2.2 药用价值 2
1.3 扩大喜树碱药源途径的研究 3
1.3.1 组织培养及喜树细胞悬浮培养 3
1.3.2 利用毛状根培养技术生产喜树碱 4
1.3.2.1 发根农杆菌的特性 4
1.3.2.2 毛状根的转化方法、培养和鉴定 5
1.4 光照对喜树培养的影响 5
1.4.1 光照对毛状根生长及其次生代谢产物合成因素的影响 5
1.4.2 光照对喜树愈合组织生理及喜树碱合成的影响 6
1.4.3 光强对喜树幼苗叶片次生代谢产物喜树碱的影响 6
1.5 大孔吸附树脂吸附原理 6
1.6 喜树碱的富集与检测 7
1.7 本课题研究的内容 7
2. 喜树发根培养 7
2.1 喜树枝条不同组织及基本培养基的筛选 7
2.2 不同种类、浓度的植物生长调节剂对喜树茎段腋芽、不定根的诱导 9
2.3 发根农杆菌感染喜树茎的培养 10
3 喜树发根培养基中次生代谢产物喜树碱提取 11
3.1 试验材料与仪器 11
3.1.1 试验材料 11
3.1.2 试验仪器 11
3.1.3 色谱条件 11
3.2 试验方法 11
3.2.1 标液的配置 11
3.2.2 喜树培养基中喜树碱等有效成分富集试验 12
4 HPLC法检测喜树碱等喜树有效成分 12
4.1 标准曲线的测定 12
4.2 空白养基中喜树碱的抽滤氯仿萃取与树脂吸附的对比 15
4.3 培养基中富集喜树碱等有效成分的HPLC检测结果 15
4.3.1 培养基中培养产物喜树碱等有效成分的检测 15
4.3.2 喜树培养基经抽滤处理后滤渣与滤液中喜树碱含量的对比 16
4.3.3 喜树培养基中喜树碱等有效成分的检测结果 17
5 总结与讨论 20
5.1 结论 20
5.2 存在问题与展望 20
5.2.1 存在的问题 20
5.2.2 展望 21
参 考 文 献 22
英 文 摘 要 24
致 谢 25
1 绪论
1.1 前言
喜树碱是一种从喜树中分离出来具有抗癌活性的生物碱。喜树广泛分布于亚洲，在我国分布尤其多，为中国特有树种。我国的野生喜树可以作为药用的叶片和种子资源总量为2158.09t和134.99t。由于喜树主要分布在人为活动区，一直是毁林开田的砍伐对象，喜树的野生种群已相当少见。在我国，野生资源已经处于濒危状态，在某些地方已经绝迹，现存的少量的野生资源也存在灭绝的危险，而且喜树碱仍不能化学合成，所以喜树资源仍是喜树碱及其类似物的唯一来源。
面对野生喜树资源已经处于濒危，且喜树碱仍不能化学合成的残酷现状，利用现代生物技术与现代分离技术综合开发喜树和喜树碱是喜树资源的保护开发的新突破。Sakato、Arjon J等人的工作表明，通过细胞培养物中目标产物含量很小，因此至今未有实际生产的应用。发根农杆菌诱导出的毛状亘具有生长迅速、激素自养、生长条件简单、次生代谢产物含量高且稳定以及分化程度高、不易变异等特点，此外尚可以从毛状根培养物中寻找新的化合物。因此毛状根技术被认为是一条利用生物技术生产代谢新的有效途径。国内外学者在这方面。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。
参 考 文 献
[1]中国树木志编委会. 中国主要树种造林技术[M] . 北京:农业出版社，1976.
[2]杨荣和,耿礼祥,等. 贵州省喜树资源初步调查[J ] . 贵州林业科技,2001，29 (1)：32 - 36.
[3]杨学义,朱立,孙超. 喜树资源及其开发利用[J].资源与环境，2007，3(7)：618-619
[4]冯建灿,张玉洁,等. 喜树及喜树碱开发利用进展[J ] . 林业科学，2000，36 (5)：100 - 108.
[5]王洋，戴绍军，阎秀峰. 光强对喜树幼苗叶片次生代谢产物喜树碱的影响[N]. 生态学报，
2004，24（6）：1118-1122.
[6]顾青，朱睦元. 光照对喜树愈合组织生理及喜树碱合成的影响[N].浙江林学院学报，
2006，23(3)：280～28
[7]刘展眉，崔英德，宾淑英. 喜树及喜树碱研究中的生物技术应用[J].广东化工，2006，（6）：67-70.
[8]刘高，饶力群 ，杨华.影响毛状根生长及其次生代谢产物合成因素的研究进展[J].生物技术通讯，2007，5（1）：888-890
[9]孙君明，丁安林，沈黎明．光照对大豆幼苗组织中异黄酮含量和分布的影响[J]．植物学报，1998,40(1)：1015
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[11]杨睿，付春祥，金治平，等．不同理化因子对雪莲毛状根生长和总黄酮生物合成的影响．生物工程学报，2005，21(21)：234
[12]杨荣和，耿礼洋，龙秀琴，等．贵州省喜树资源初步调查[J]．贵州林业科技，2001，29(1)：32236．
[13]Griffith EC，Niwayama S，Ramsay CA，Chang YH．Molecular recognition of angiogenesis inhibitors fumagillin and ovalicin by methionine aminopeptidase2[J]．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998,195(26)：15183-15188．
[14]Sakato．K，Misawa M．Efects of chemical and Physical conditions on growth of Camptotheca acuminata cell cultures，Agr. Biol. Chem．，1974，38：491-497．
[15]Sakato I.，Tanaka H.，et a1．Isolation and identification of camptothecin from cells of Camptotheca acuminata suspension cultures．Agr.Bio1．Chem．，1974，38：2l7-2l8．
[16]Arjon．J．van Hengel M．P．Harkes et a1．，Characterization of callus formation and camptothecin Production by cell lines of Can Ptothecaacuina, Plant cell，Tissure and Oran Culture，1992．28：11-18．
[17]Sakato，K．，Tanaka.H.，Mukai，N．，Misawa, M．，1974．Isolation and identification of camptothecin from cells of Camptotheca acuminata suspension cultures．Agric．Bio1．Chem．38，217-218．
[18]Wiedenfeld，H．Furmanowa, M．Roeder,E．Guzewska, J．Gustowski，W，1997．Camptothecin and 10-hydroxycamptothecin in callus and plantlets of Camptotheca acuminata．Plant Cell Tiss．Org．Cult．49,213-2l8．
[19]A.K.Jain&C．L.Nessler．Clonal Propagation of Calptotheca acuminata through shoot bud culture．Plant Cel1.Tiss．And Org．Culture. 1996．44：229-233．
[20]Ciddi，V．，Shuler，M.L.，2000.Camptothecin from callus cultures of Nothapodytes foetida．Biotechno1.Lett.22,129-132．
[21]Fulzele，D.P.，Satdive，R.K，Pol，B.B 2001．Growth and production of camptothecin by cell suspension cultures of Nothapodytes foetida．Planta Med．67,15-l52．
[22]Tanaka N，Hayakawa M，Mano Y, et al，1985．Infection of turnip and radish storage roots with Agrobacterium rhizogenes[J]．Plant Cell Report,4：74-77．
[23]Zheng ZR，Peng JS，Liu D, et al，1997．The mass culture of the hairy roots of Astragalus membranaceus[J]．Plant Physiol Commun，32(2)：l33-134．
[24]Zhou YQ，Zhang FG,Yuan BJ，1996．Review of studies on obtaining transgenic plants by Agrohacterium rhizogenes mediated gene transfer system[J]．Hereditas，18(4)：45．
[25]Shanks JV,BhadraR,Rijhwani S，et a1．Biotechnology and Bioengineering．1998，58：333
[26]Liu SN，Sun TE，Li GB，1998．Transformation of Ginkgo hairy root and establishmentofits suspension culture [J]．J Wuhan Univ(Natural Science Edition)(武汉大学学报-自然科学版)．1998, 44(2)：l53-156．
[27]Wiedellfeld Helmut，Meroslawa Furmanowa,Erhard Roeder,Joanna Gu．Plant Cell Tissue and Organ Culture.1997, 49(3)：213-2l8．
