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毕业论文 表皮生长因子体外定向进化及对其结构与功能之间关系的研究,目录目录i摘要iiiabstractv第一章 文献综述- 1 -1.1 表皮生长因子及其家族- 1 -1.1.1表皮生长因子理化性质- 1 -1.1.2 egf的生理功能及应用- 3 -1.1.3 egf生理功能的作用机制- 4 -1.1.4 egf家族成员及其结构与功能特性- 7 -1.2 egf受体（egfr）的生...
内容介绍
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目录
目录 I
摘要 III
Abstract V
第一章 文献综述 - 1 -
1.1 表皮生长因子及其家族 - 1 -
1.1.1表皮生长因子理化性质 - 1 -
1.1.2 EGF的生理功能及应用 - 3 -
1.1.3 EGF生理功能的作用机制 - 4 -
1.1.4 EGF家族成员及其结构与功能特性 - 7 -
1.2 EGF受体（EGFR）的生理特性及其研究进展 - 7 -
1.2.1 EGFR的生理特性及信号传导途径 - 7 -
1.2.2 EGFR在癌症发生、发展及治疗中作用的研究现状 - 9 -
1.3 本研究的方法与技术 - 12 -
1.3.1 本研究的技术路线 - 12 -
1.3.2 定向进化技术及本研究采用的改组策略 - 12 -
1.3.3 噬菌体展示高通量筛选技术 - 16 -
1.3.4 圆二色谱技术在生物学领域的应用 - 18 -
第二章 EGF定向突变文库的构建 - 22 -
2.1 材料与方法 - 22 -
2.1.1 实验材料 - 22 -
2.1.2 方法 - 24 -
2.2 结果与分析 - 28 -
2.2.1 易错PCR诱变hEGF与pEGF - 28 -
2.2.2 StEP重组文库的建立 - 30 -
2.3 讨论 - 31 -
2.3.1 进化亲本的选择 - 31 -
2.3.2 易错PCR条件的优化 - 32 -
2.3.3 StEP条件的选择 - 33 -
2.4 小结 - 34 -
第三章 突变文库的亲和性筛选及阳性克隆的表达、纯化及活性检测 - 35 -
3.1 材料与方法 - 35 -
3.1.1实验材料 - 35 -
3.1.2 方法 - 38 -
3.2 结果与分析 - 43 -
3.2.1 噬菌体表面展示文库的建立 - 43 -
3.2.2 噬菌体展示文库的淘洗筛选 - 44 -
3.2.2 细胞ELISA筛选淘洗后文库 - 44 -
3.3 讨论 - 45 -
3.3.1 细胞表面噬菌体展示文库的筛选 - 45 -
3.3.2 ELISA方法的选择 - 47 -
3.4 小结 - 48 -
第四章 噬菌体展示阳性克隆的表达与活性检测 - 49 -
4.1 材料与方法 - 49 -
4.1.1实验材料 - 49 -
4.1.2 方法 - 51 -
4.2 结果与分析 - 56 -
4.2.1 阳性克隆表达载体的构建 - 56 -
4.2.2 重组EGF的表达及纯化 - 57 -
4.2.3 MTT分析重组蛋白活性 - 58 -
4.2.4 重组子序列的测定分析 - 58 -
4.2.5 EGF E40V表达条件的优化 - 59 -
4.2.6 优化条件下的表达规模扩增 - 60 -
4.2.7 纯化蛋白的透析与蛋白浓度的测定 - 63 -
4.3 讨论 - 64 -
4.3.1 大肠杆菌融合性表达重组EGF - 64 -
4.3.2 原核表达蛋白的纯化 - 66 -
4.3.3 MTT实验条件的调整 - 68 -
4.3.4 重组EGF序列突变位点的分析 - 69 -
4.4 小结 - 69 -
第五章 EGF Y13G突变体的获得、EGF的pET28a重组表达与样品的圆二色谱分析 - 71 -
5.1 材料与方法 - 71 -
5.1.1 材料 - 71 -
5.1.2 方法 - 72 -
5.2 结果与分析 - 75 -
5.2.1 pET28a-EGF重组表达条件的优化 - 75 -
5.2.2 纯化蛋白样品的圆二色谱测定分析 - 78 -
5.3 讨论 - 79 -
5.3.1 pET28a重组表达EGF - 79 -
5.3.2 圆二色谱检测EGF二级结构 - 80 -
5.4 小结 - 81 -
第六章 总结与展望 - 82 -
6.1 总结 - 82 -
6.2 展望 - 82 -
缩略词表 - 84 -
参考文献 - 86 -
致 谢 - 93 -
表皮生长因子体外定向进化及对其结构与功能之间关系的研究
生物化学与分子生物学
摘要
人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)发现于1962 年，是一种由53 个氨基酸残基组成的单体多肽。已证实hEGF 是一种关键性的创伤愈合因子，通过与其受体的结合，它能对上皮细胞和间质细胞产生很强的致分裂作用；能促进皮肤、角膜、肺和气管上皮组织等的增殖和分化；对表皮损伤和溃疡具有卓越修复功能；临床上对肠、胃、肝等器官表面损伤的修复和再生也有显著疗效。总之，hEGF在医疗、美容护肤等方面有着广泛的应用前景。
但是由于其自身半衰期较短等不利因素，至今尚未得到广泛的使用，利用分子手段将它进行改造已成为必然。针对EGF的三维结构已比较清楚但结构和功能之间的关系并不清楚而且EGF分子本身很小不利于改组的情况，本研究采用易错PCR和StEP联合的方法将hEGF和pEGF的DNA进行分子定向进化。通过多次尝试，探索了简便、有效、优化的EGF体外定向进化的技术路线，构建了定向进化文库，用SSCP初步检测文库突变率可以达到其它大分子改组的水平。然后将突变文库构建成噬菌体展示文库，通过活细胞噬菌体展示、ELISA和MTT的方法筛选到活性增强的突变体EGF26，为EGF体外定向进化提供可借鉴经验。通过测序我们发现了其突变为40Glu→Val，为了解这一突变引起的二级结构变化，对EGF26和hEGF进行了圆二色谱的检测，并分析了这些变化对EGF活性增强的贡献，为了解EGF结构与功能之间联系打开新的视角。
此外，本研究构建了pET32a(+)-EGF26 重组质粒，以本实验室构建保存的pET32a(+)-hEGF为对照，用BL21为宿主菌进行融合表达。通过表达条件的优化最终确定在37℃，菌液初始OD600=0.5，IPTG 0.5mmol/L，诱导时间6 小时的条件下EGF得到最高的溶解性表达，而且使用金属螯合亲和层析纯化后结果表明，EGF26的溶解性表达优于hEGF，为EGF26的最终应用打下基础。
关键词：表皮生长因子 定向进化 噬菌体展示 CD谱 溶解性表达 二级结构
目录 I
摘要 III
Abstract V
第一章 文献综述 - 1 -
1.1 表皮生长因子及其家族 - 1 -
1.1.1表皮生长因子理化性质 - 1 -
1.1.2 EGF的生理功能及应用 - 3 -
1.1.3 EGF生理功能的作用机制 - 4 -
1.1.4 EGF家族成员及其结构与功能特性 - 7 -
1.2 EGF受体（EGFR）的生理特性及其研究进展 - 7 -
1.2.1 EGFR的生理特性及信号传导途径 - 7 -
1.2.2 EGFR在癌症发生、发展及治疗中作用的研究现状 - 9 -
1.3 本研究的方法与技术 - 12 -
1.3.1 本研究的技术路线 - 12 -
1.3.2 定向进化技术及本研究采用的改组策略 - 12 -
1.3.3 噬菌体展示高通量筛选技术 - 16 -
1.3.4 圆二色谱技术在生物学领域的应用 - 18 -
第二章 EGF定向突变文库的构建 - 22 -
2.1 材料与方法 - 22 -
2.1.1 实验材料 - 22 -
2.1.2 方法 - 24 -
2.2 结果与分析 - 28 -
2.2.1 易错PCR诱变hEGF与pEGF - 28 -
2.2.2 StEP重组文库的建立 - 30 -
2.3 讨论 - 31 -
2.3.1 进化亲本的选择 - 31 -
2.3.2 易错PCR条件的优化 - 32 -
2.3.3 StEP条件的选择 - 33 -
2.4 小结 - 34 -
第三章 突变文库的亲和性筛选及阳性克隆的表达、纯化及活性检测 - 35 -
3.1 材料与方法 - 35 -
3.1.1实验材料 - 35 -
3.1.2 方法 - 38 -
3.2 结果与分析 - 43 -
3.2.1 噬菌体表面展示文库的建立 - 43 -
3.2.2 噬菌体展示文库的淘洗筛选 - 44 -
3.2.2 细胞ELISA筛选淘洗后文库 - 44 -
3.3 讨论 - 45 -
3.3.1 细胞表面噬菌体展示文库的筛选 - 45 -
3.3.2 ELISA方法的选择 - 47 -
3.4 小结 - 48 -
第四章 噬菌体展示阳性克隆的表达与活性检测 - 49 -
4.1 材料与方法 - 49 -
4.1.1实验材料 - 49 -
4.1.2 方法 - 51 -
4.2 结果与分析 - 56 -
4.2.1 阳性克隆表达载体的构建 - 56 -
4.2.2 重组EGF的表达及纯化 - 57 -
4.2.3 MTT分析重组蛋白活性 - 58 -
4.2.4 重组子序列的测定分析 - 58 -
4.2.5 EGF E40V表达条件的优化 - 59 -
4.2.6 优化条件下的表达规模扩增 - 60 -
4.2.7 纯化蛋白的透析与蛋白浓度的测定 - 63 -
4.3 讨论 - 64 -
4.3.1 大肠杆菌融合性表达重组EGF - 64 -
4.3.2 原核表达蛋白的纯化 - 66 -
4.3.3 MTT实验条件的调整 - 68 -
4.3.4 重组EGF序列突变位点的分析 - 69 -
4.4 小结 - 69 -
第五章 EGF Y13G突变体的获得、EGF的pET28a重组表达与样品的圆二色谱分析 - 71 -
5.1 材料与方法 - 71 -
5.1.1 材料 - 71 -
5.1.2 方法 - 72 -
5.2 结果与分析 - 75 -
5.2.1 pET28a-EGF重组表达条件的优化 - 75 -
5.2.2 纯化蛋白样品的圆二色谱测定分析 - 78 -
5.3 讨论 - 79 -
5.3.1 pET28a重组表达EGF - 79 -
5.3.2 圆二色谱检测EGF二级结构 - 80 -
5.4 小结 - 81 -
第六章 总结与展望 - 82 -
6.1 总结 - 82 -
6.2 展望 - 82 -
缩略词表 - 84 -
参考文献 - 86 -
致 谢 - 93 -
表皮生长因子体外定向进化及对其结构与功能之间关系的研究
生物化学与分子生物学
摘要
人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)发现于1962 年，是一种由53 个氨基酸残基组成的单体多肽。已证实hEGF 是一种关键性的创伤愈合因子，通过与其受体的结合，它能对上皮细胞和间质细胞产生很强的致分裂作用；能促进皮肤、角膜、肺和气管上皮组织等的增殖和分化；对表皮损伤和溃疡具有卓越修复功能；临床上对肠、胃、肝等器官表面损伤的修复和再生也有显著疗效。总之，hEGF在医疗、美容护肤等方面有着广泛的应用前景。
但是由于其自身半衰期较短等不利因素，至今尚未得到广泛的使用，利用分子手段将它进行改造已成为必然。针对EGF的三维结构已比较清楚但结构和功能之间的关系并不清楚而且EGF分子本身很小不利于改组的情况，本研究采用易错PCR和StEP联合的方法将hEGF和pEGF的DNA进行分子定向进化。通过多次尝试，探索了简便、有效、优化的EGF体外定向进化的技术路线，构建了定向进化文库，用SSCP初步检测文库突变率可以达到其它大分子改组的水平。然后将突变文库构建成噬菌体展示文库，通过活细胞噬菌体展示、ELISA和MTT的方法筛选到活性增强的突变体EGF26，为EGF体外定向进化提供可借鉴经验。通过测序我们发现了其突变为40Glu→Val，为了解这一突变引起的二级结构变化，对EGF26和hEGF进行了圆二色谱的检测，并分析了这些变化对EGF活性增强的贡献，为了解EGF结构与功能之间联系打开新的视角。
此外，本研究构建了pET32a(+)-EGF26 重组质粒，以本实验室构建保存的pET32a(+)-hEGF为对照，用BL21为宿主菌进行融合表达。通过表达条件的优化最终确定在37℃，菌液初始OD600=0.5，IPTG 0.5mmol/L，诱导时间6 小时的条件下EGF得到最高的溶解性表达，而且使用金属螯合亲和层析纯化后结果表明，EGF26的溶解性表达优于hEGF，为EGF26的最终应用打下基础。
关键词：表皮生长因子 定向进化 噬菌体展示 CD谱 溶解性表达 二级结构
