多糖－蛋白结合疫苗与核酸佐剂的研制.doc
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多糖－蛋白结合疫苗与核酸佐剂的研制,及免疫特性研究页数 66字数39906摘要 此为硕士研究论文 特异性多糖疫苗在抗病原体感染，激活体内免疫系统等方面发挥了重要的作用。然而，多糖是t细胞非依赖型抗原，在体内不能产生免疫记忆，对免疫功能低下者无明显作用。新型多糖－蛋白结合疫苗能在体内激活t细胞，改善多糖疫苗的功能，成为新型...
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多糖－蛋白结合疫苗与核酸佐剂的研制及免疫特性研究
页数 66 字数 39906
摘要
此为硕士研究论文
特异性多糖疫苗在抗病原体感染，激活体内免疫系统等方面发挥了重要的作用。然而，多糖是T细胞非依赖型抗原，在体内不能产生免疫记忆，对免疫功能低下者无明显作用。新型多糖－蛋白结合疫苗能在体内激活T细胞，改善多糖疫苗的功能，成为新型疫苗的研发热点。
本工作研究了多糖－蛋白结合疫苗的制备方法和对多糖抗原免疫原性的保护措施。采用双环氧试剂1,4-二丁醇二缩水甘油醚进行肺炎球菌荚膜多糖与蛋白BSA的结合。考察了荚膜多糖/结合试剂配比、反应温度、反应时间等制备条件与荚膜多糖活化度的关系，建立了过程可控、质量可控的制备工艺。通过严格控制制备条件，可有效地将荚膜多糖活化度控制在所需的数量级。
对不同活化度荚膜多糖的免疫原性研究结果表明，活化度的增加导致多糖免疫原性减弱。当多糖活化度低于10时，可有效地保持多糖的免疫原性。本实验制备的荚膜多糖－蛋白的结合物中，相同多糖用量情况下，蛋白用量的增加能够促进血清中抗多糖抗体类型由IgM向IgG转变，分别提高结合物抗多糖、抗蛋白IgG抗体滴度。
本工作分别从肺炎球菌和大肠杆菌培养物中分离纯化DNA，采用超声波对所提取的细菌DNA进行物理降解，制备成大分子量（约21000bp）和小分子量（约400bp）的DNA佐剂。小鼠免疫实验表明，细菌DNA佐剂使用安全，本实验中大剂量腹腔注射未见小鼠有不良反应。小分子量DNA佐剂的免疫增强作用弱于大分子量DNA佐剂，DNA分子在体内的降解可能是其重要原因。采用氢氧化铝胶体吸附可使其在体内缓释，极显著地提高DNA佐剂的免疫增强作用。
研究了不同佐剂对多糖抗原、蛋白抗原和多糖－蛋白结合物抗原的免疫增强作用。氢氧化铝佐剂能增加多糖－蛋白结合物诱生的抗多糖IgG抗体滴度，极其显著地增加抗蛋白及抗结合物自身的IgG抗体滴度。细菌DNA佐剂的整体免疫增强作用弱于氢氧化铝佐剂，但其能在体内诱导Th1型免疫应答，使IgG2a/IgG1比值上升，激活免疫细胞杀灭病原体。
以体外培养的脾细胞为模型，研究添加佐剂后脾细胞活性和TLR－9蛋白表达量的变化。体外实验和体内实验结果具有可比性。提示脾细胞体外培养模型有可能作为佐剂筛选和佐剂作用机理研究的一种手段。
本研究对荚膜多糖－BSA结合疫苗制备及免疫原性和对DNA佐剂制备及免疫增强作用的研究结果对于下阶段新型肺炎球菌荚膜多糖－外膜蛋白结合疫苗的研发提供了重要依据。
关键词：荚膜多糖，蛋白，结合疫苗，细菌DNA，佐剂，脾细胞
目 录
第一章 引 言 1
1.1 疫苗 1
1.1.1 多糖疫苗 1
1.1.2 蛋白疫苗 2
1.1.3 多糖－蛋白结合疫苗 2
1.1.4 抗肺炎球菌感染类疫苗 3
1.1.4.1 肺炎球菌 3
1.1.4.2 肺炎球菌的多糖疫苗 4
1.1.4.3 肺炎球菌的多糖－蛋白结合疫苗 4
1.2 多糖－蛋白结合疫苗的制备技术 5
1.2.1 结合疫苗制备技术的要求 6
1.2.2 双环氧试剂结合法 6
1.3 佐剂 7
1.3.1 佐剂的作用 7
1.3.2 佐剂诱导的免疫应答方式 8
1.3.3 传统佐剂 9
1.3.3.1 福氏佐剂 9
1.3.3.2 含铝佐剂 9
1.3.4 CpG 佐剂 10
1.3.4.1 CpG 佐剂的免疫机制 10
1.3.4.2 CpG 佐剂的构效关系 12
1.3.4.3 CpG 佐剂的应用 14
1.3.4.4 CpG佐剂的前景 14
1.4 本工作的主要研究内容与主要创新点 16
1.4.1 主要研究内容 16
1.4.2 主要创新点 16
第二章 多糖－蛋白结合疫苗制备及免疫原性研究 17
2.1 材料 17
2.1.1菌种 17
2.1.2 实验动物 17
2.1.3 主要实验仪器 17
2.1.4 主要实验药品 17
2.1.5 培养基 18
2.2 方法 18
2.2.1 肺炎球菌荚膜多糖的分离纯化 18
2.2.1.1 肺炎球菌的培养 18
2.2.1.2 粗多糖的制备 18
2.2.1.3 离子交换层析法纯化荚膜多糖 18
2.2.2 荚膜多糖－蛋白结合物的制备 19
2.2.3 检测方法 19
2.2.3.1 多糖含量检测 19
2.2.3.2 蛋白质含量的检测 19
2.2.3.3 活化多糖上活性结合基团数目的测定 20
2.2.3.4 SDS-PAGE电泳检测 20
2.2.3.5 HPLC检测 21
2.2.4 免疫原性的研究 22
2.2.4.1 小鼠免疫 22
2.2.4.2 抗体滴度的ELISA检测（间接法） 22
2.2.4.3 数据分析 22
2.3 结果与讨论 23
2.3.1 荚膜多糖的制备 23
2.3.2 肺炎球菌6B型荚膜多糖的特性鉴定 24
2.3.3 多糖－蛋白结合方法研究 24
2.3.3.1 多糖蛋白结合物的制备 24
2.3.3.2 结合产物的HPLC分析 25
2.3.3.3 多糖－蛋白结合产物的电泳分析 28
2.3.4 结合试剂用量与多糖活化时间对多糖活化度的影响 29
2.3.5 不同活化度对多糖的免疫原性的影响 29
2.3.6 不同多糖：蛋白结合比例结合物的制备及免疫原性研究 30
2.3.7 不同佐剂对多糖-蛋白结合物的免疫增强作用 33
2.4 小结 36
第三章 核酸佐剂的制备与免疫增强作用研究 37
3.1 材料 37
3.1.1菌种 37
3.1.2 实验动物 37
3.1.3 主要实验仪器 37
3.1.4 主要实验药品 37
3.2 方法 38
3.2.1 细菌总DNA的提取和纯化 38
3.2.2 提取DNA纯度的检测 38
3.2.3 佐剂的制备 39
3.2.3.1 DNA 佐剂的制备 39
3.2.3.2 氢氧化铝佐剂的制备 39
3.2.3.3 合成佐剂CPG－ODN的制备 39
3.2.3.4 混合佐剂的制备 39
3.2.4 佐剂免疫增强作用的考察 39
3.2.4.1小鼠免疫实验 39
3.2.4.2 体外小鼠脾细胞刺激实验 39
3.3 结果与讨论 41
3.3.1 细菌总DNA的提取制备 41
3.3.2 提取DNA的特征分析 41
3.3.2.1 紫外扫描 41
3.3.2.2 琼脂糖凝胶电泳 42
3.3.3 DNA佐剂对BSA抗原的免疫增强作用 43
3.3.3.1 大分子量DNA佐剂的免疫增强作用 43
3.3.3.2 小分子量DNA佐剂对BSA的免疫增强作用 44
3.3.4 DNA佐剂和其它佐剂对BSA抗原的免疫增强作用 45
3.3.5 DNA佐剂对小鼠脾细胞的刺激作用 46
3.3.6 DNA佐剂对TLR-9受体表达的增强作用 48
3.3.7 DNA佐剂和氢氧化铝佐剂对多糖抗原的免疫增强作用 49
3.3.8 不同佐剂对不同抗原的免疫增强作用 50
3.4 小结 51
第四章 结论与展望 52
4.1 结论 52
4.2 展望 53
参考文献 54
致 谢 60
参考文献
[1]张欠欠,惠清发,赵学忠.疫苗研制及应用的研究现状与展望.延安大学学报(自然科学版),2005, 24(4):78.
[2]董德祥主编.疫苗技术基础与应用.北京:化学工业出版社.2002.
[3]刘纯杰.疫苗研制技术的现状与展望.微生物学免疫学进展,2002,30(3):6264.
[4]董群,方积年.多糖在医药领域中的应用.中国药学杂志,2001,36(10):649.
[5]翟少钦,左之才.生物多糖免疫作用的研究进展及应用.中兽医学杂志, 2001,(3):2
页数 66 字数 39906
摘要
此为硕士研究论文
特异性多糖疫苗在抗病原体感染，激活体内免疫系统等方面发挥了重要的作用。然而，多糖是T细胞非依赖型抗原，在体内不能产生免疫记忆，对免疫功能低下者无明显作用。新型多糖－蛋白结合疫苗能在体内激活T细胞，改善多糖疫苗的功能，成为新型疫苗的研发热点。
本工作研究了多糖－蛋白结合疫苗的制备方法和对多糖抗原免疫原性的保护措施。采用双环氧试剂1,4-二丁醇二缩水甘油醚进行肺炎球菌荚膜多糖与蛋白BSA的结合。考察了荚膜多糖/结合试剂配比、反应温度、反应时间等制备条件与荚膜多糖活化度的关系，建立了过程可控、质量可控的制备工艺。通过严格控制制备条件，可有效地将荚膜多糖活化度控制在所需的数量级。
对不同活化度荚膜多糖的免疫原性研究结果表明，活化度的增加导致多糖免疫原性减弱。当多糖活化度低于10时，可有效地保持多糖的免疫原性。本实验制备的荚膜多糖－蛋白的结合物中，相同多糖用量情况下，蛋白用量的增加能够促进血清中抗多糖抗体类型由IgM向IgG转变，分别提高结合物抗多糖、抗蛋白IgG抗体滴度。
本工作分别从肺炎球菌和大肠杆菌培养物中分离纯化DNA，采用超声波对所提取的细菌DNA进行物理降解，制备成大分子量（约21000bp）和小分子量（约400bp）的DNA佐剂。小鼠免疫实验表明，细菌DNA佐剂使用安全，本实验中大剂量腹腔注射未见小鼠有不良反应。小分子量DNA佐剂的免疫增强作用弱于大分子量DNA佐剂，DNA分子在体内的降解可能是其重要原因。采用氢氧化铝胶体吸附可使其在体内缓释，极显著地提高DNA佐剂的免疫增强作用。
研究了不同佐剂对多糖抗原、蛋白抗原和多糖－蛋白结合物抗原的免疫增强作用。氢氧化铝佐剂能增加多糖－蛋白结合物诱生的抗多糖IgG抗体滴度，极其显著地增加抗蛋白及抗结合物自身的IgG抗体滴度。细菌DNA佐剂的整体免疫增强作用弱于氢氧化铝佐剂，但其能在体内诱导Th1型免疫应答，使IgG2a/IgG1比值上升，激活免疫细胞杀灭病原体。
以体外培养的脾细胞为模型，研究添加佐剂后脾细胞活性和TLR－9蛋白表达量的变化。体外实验和体内实验结果具有可比性。提示脾细胞体外培养模型有可能作为佐剂筛选和佐剂作用机理研究的一种手段。
本研究对荚膜多糖－BSA结合疫苗制备及免疫原性和对DNA佐剂制备及免疫增强作用的研究结果对于下阶段新型肺炎球菌荚膜多糖－外膜蛋白结合疫苗的研发提供了重要依据。
关键词：荚膜多糖，蛋白，结合疫苗，细菌DNA，佐剂，脾细胞
目 录
第一章 引 言 1
1.1 疫苗 1
1.1.1 多糖疫苗 1
1.1.2 蛋白疫苗 2
1.1.3 多糖－蛋白结合疫苗 2
1.1.4 抗肺炎球菌感染类疫苗 3
1.1.4.1 肺炎球菌 3
1.1.4.2 肺炎球菌的多糖疫苗 4
1.1.4.3 肺炎球菌的多糖－蛋白结合疫苗 4
1.2 多糖－蛋白结合疫苗的制备技术 5
1.2.1 结合疫苗制备技术的要求 6
1.2.2 双环氧试剂结合法 6
1.3 佐剂 7
1.3.1 佐剂的作用 7
1.3.2 佐剂诱导的免疫应答方式 8
1.3.3 传统佐剂 9
1.3.3.1 福氏佐剂 9
1.3.3.2 含铝佐剂 9
1.3.4 CpG 佐剂 10
1.3.4.1 CpG 佐剂的免疫机制 10
1.3.4.2 CpG 佐剂的构效关系 12
1.3.4.3 CpG 佐剂的应用 14
1.3.4.4 CpG佐剂的前景 14
1.4 本工作的主要研究内容与主要创新点 16
1.4.1 主要研究内容 16
1.4.2 主要创新点 16
第二章 多糖－蛋白结合疫苗制备及免疫原性研究 17
2.1 材料 17
2.1.1菌种 17
2.1.2 实验动物 17
2.1.3 主要实验仪器 17
2.1.4 主要实验药品 17
2.1.5 培养基 18
2.2 方法 18
2.2.1 肺炎球菌荚膜多糖的分离纯化 18
2.2.1.1 肺炎球菌的培养 18
2.2.1.2 粗多糖的制备 18
2.2.1.3 离子交换层析法纯化荚膜多糖 18
2.2.2 荚膜多糖－蛋白结合物的制备 19
2.2.3 检测方法 19
2.2.3.1 多糖含量检测 19
2.2.3.2 蛋白质含量的检测 19
2.2.3.3 活化多糖上活性结合基团数目的测定 20
2.2.3.4 SDS-PAGE电泳检测 20
2.2.3.5 HPLC检测 21
2.2.4 免疫原性的研究 22
2.2.4.1 小鼠免疫 22
2.2.4.2 抗体滴度的ELISA检测（间接法） 22
2.2.4.3 数据分析 22
2.3 结果与讨论 23
2.3.1 荚膜多糖的制备 23
2.3.2 肺炎球菌6B型荚膜多糖的特性鉴定 24
2.3.3 多糖－蛋白结合方法研究 24
2.3.3.1 多糖蛋白结合物的制备 24
2.3.3.2 结合产物的HPLC分析 25
2.3.3.3 多糖－蛋白结合产物的电泳分析 28
2.3.4 结合试剂用量与多糖活化时间对多糖活化度的影响 29
2.3.5 不同活化度对多糖的免疫原性的影响 29
2.3.6 不同多糖：蛋白结合比例结合物的制备及免疫原性研究 30
2.3.7 不同佐剂对多糖-蛋白结合物的免疫增强作用 33
2.4 小结 36
第三章 核酸佐剂的制备与免疫增强作用研究 37
3.1 材料 37
3.1.1菌种 37
3.1.2 实验动物 37
3.1.3 主要实验仪器 37
3.1.4 主要实验药品 37
3.2 方法 38
3.2.1 细菌总DNA的提取和纯化 38
3.2.2 提取DNA纯度的检测 38
3.2.3 佐剂的制备 39
3.2.3.1 DNA 佐剂的制备 39
3.2.3.2 氢氧化铝佐剂的制备 39
3.2.3.3 合成佐剂CPG－ODN的制备 39
3.2.3.4 混合佐剂的制备 39
3.2.4 佐剂免疫增强作用的考察 39
3.2.4.1小鼠免疫实验 39
3.2.4.2 体外小鼠脾细胞刺激实验 39
3.3 结果与讨论 41
3.3.1 细菌总DNA的提取制备 41
3.3.2 提取DNA的特征分析 41
3.3.2.1 紫外扫描 41
3.3.2.2 琼脂糖凝胶电泳 42
3.3.3 DNA佐剂对BSA抗原的免疫增强作用 43
3.3.3.1 大分子量DNA佐剂的免疫增强作用 43
3.3.3.2 小分子量DNA佐剂对BSA的免疫增强作用 44
3.3.4 DNA佐剂和其它佐剂对BSA抗原的免疫增强作用 45
3.3.5 DNA佐剂对小鼠脾细胞的刺激作用 46
3.3.6 DNA佐剂对TLR-9受体表达的增强作用 48
3.3.7 DNA佐剂和氢氧化铝佐剂对多糖抗原的免疫增强作用 49
3.3.8 不同佐剂对不同抗原的免疫增强作用 50
3.4 小结 51
第四章 结论与展望 52
4.1 结论 52
4.2 展望 53
参考文献 54
致 谢 60
参考文献
[1]张欠欠,惠清发,赵学忠.疫苗研制及应用的研究现状与展望.延安大学学报(自然科学版),2005, 24(4):78.
[2]董德祥主编.疫苗技术基础与应用.北京:化学工业出版社.2002.
[3]刘纯杰.疫苗研制技术的现状与展望.微生物学免疫学进展,2002,30(3):6264.
[4]董群,方积年.多糖在医药领域中的应用.中国药学杂志,2001,36(10):649.
[5]翟少钦,左之才.生物多糖免疫作用的研究进展及应用.中兽医学杂志, 2001,(3):2
