中性粒细胞淋球菌感染模型的建立-毕业论文.doc
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中性粒细胞淋球菌感染模型的建立-毕业论文, 【摘要】 目的 研究诱导型一氧化氮合酶(inos)及一氧化氮(no)在中性粒细胞淋球菌感染模型中的表达。方法 分离正常人外周血中性粒细胞，在10%胎牛血清dmem培养液上培养3 h，a组加入空白培养基，b组加入淋球菌菌液，随后在0、3、8、12 h分别以实时定量荧光pcr测定inos mrna表达，用镉还原法检测no...
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【摘要】 目的 研究诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及一氧化氮(NO)在中性粒细胞淋球菌感染模型中的表达。方法 分离正常人外周血中性粒细胞，在10%胎牛血清DMEM培养液上培养3 h，A组加入空白培养基，B组加入淋球菌菌液，随后在0、3、8、12 h分别以实时定量荧光PCR测定iNOS mRNA表达，用镉还原法检测NO浓度。结果 B组中iNOS mRNA表达和NO水平均较A组升高(P<0.01)，NO浓度在8 h达到高峰。结论 中性粒细胞淋球菌感染模型可成功模拟该菌体内微氧感染环境，可用于研究淋球菌致病机制。
【关键词】 淋球菌;中性粒细胞;一氧化氮
Establishment of gonococcus?induced neutrophil infection model
CHEN Rong?yi, ZHANG Guo?xue, CHEN Lei, FAN Yi?ming, WU Zhi?hua (Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China)
Abstract:Objective To investigate the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and nitric oxide (NO) in gonococcus?induced neutrophil infection model. Methods Peripheral blood neutrophils were islolated from health men, and then cultured in DMEM medium containing 10% fetal calf serum for 3 h. Blank medium or gonococcal inocula was added into group A or group B. NO concentration and iNOS mRNA expression at 0, 3, 8 and 12 h were determined by cadmium reduction method and real?time quantitative fluorescent PCR, respectively.Results Compared with group A, iNOS mRNA expression and NO level increased obviously in group B (P<0.01), and NO content peaked at 8 h.Conclusion The gonococcus?induced neutrophil infection model can simulate the micro?oxygen infection circumstance in vivo, and is suitable for studying the pathogenic mechanism of gonococcus.
Key words: gonococcus; neutrophil; nitric oxide
淋球菌为兼性厌氧的革兰阴性双球菌，可引起生殖系统急性化脓性炎症，脓性分泌物中存在大量中性粒细胞[1]。中性粒细胞是一种专职吞噬细胞，感染初期可在炎症介质的介导下聚集在病灶处，通过吞噬摄入致病菌[2]。中性粒细胞杀伤吞噬微生物的机制包括活性氧簇、抗菌蛋白、一氧化氮(NO)等[3]。尽管中性粒细胞在淋球菌感染初期可迅速聚集到病灶，但淋病的迁延不愈表明中性粒细胞引起的炎症反应不足以彻底清除淋球菌。中性粒细胞可杀灭大部分吞噬的细菌(如大肠杆菌)，但部分淋球菌可在中性粒细胞内生存甚至繁殖[4?5]。淋球菌是如何实现免疫逃逸并得以在中性粒细胞内生存的问题目前尚未完全阐明。本研究拟建立中性粒细胞淋球菌感染模型，观察NO和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，旨在将其用于研究淋球菌致病机制。
1 材料与方法
1.1 淋球菌菌株
淋球菌株ST2951用WGC淋球菌专用培养基培养(购自中国科学院武汉生物制品研究所)制备成OD600值为0.15的细菌悬液。
1.2 外周血中性粒细胞的分离
6名健康成年男性分别抽取2 mL肝素抗凝静脉血，取抗凝血与Hank液混匀后小心加入到人中性粒细胞分离液中(天津灏洋生物制品科技有限公司，LTS?1087)，18℃、2000 r/min离心20 min，待离心管由上至下分4层;吸取第3层(中性粒细胞)加入到含Hank液15 mL的试管中，充分混匀，2000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀反复洗涤2次，再用含10%胎牛血清DMEM培养液重新悬浮细胞(1×107/mL);充分混匀后滴入细胞培养板中，置5%CO2培养箱37℃培养3 h备用。取少量细胞液涂片，作台盼蓝拒染实验，鉴定其存活率。
1.3 中性粒细胞淋球菌感染模型的建立
取出培养板，A组每孔加入含10%胎牛血清DMEM 培养液150μL，B组每孔滴入淋球菌悬液150μL;加样完毕后继续孵育，按0、3、8、12 h时间点在培养孔中吸出培养液作相应检测，每组设3个复孔。
1.4 实时荧光定量PCR检测iNOS mRNA含量
用Trizol溶液(美国GIBCO公司)提取中性粒细胞总RNA，经紫外分光光度计检测符合纯度后逆转录为cDNA，再进行实时荧光定量PCR检测。根据GeneBank序列设计iNOS、β?actin引物，序列见表1。反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性5 s，60℃退火10 s，72℃ 延伸20 s，共40个循环。应用SYBR GreenⅠ荧光染料(美国Biotium公司)技术行实时定量PCR反应，获取各组标本的标准曲线，计算机分析Ct值(每个反应管内荧光强度达到系统认为有目的DNA合成时的循环数，以阴性对照作参考)。表1 引物序列
1.5 NO浓度检测
【关键词】 淋球菌;中性粒细胞;一氧化氮
Establishment of gonococcus?induced neutrophil infection model
CHEN Rong?yi, ZHANG Guo?xue, CHEN Lei, FAN Yi?ming, WU Zhi?hua (Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China)
Abstract:Objective To investigate the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and nitric oxide (NO) in gonococcus?induced neutrophil infection model. Methods Peripheral blood neutrophils were islolated from health men, and then cultured in DMEM medium containing 10% fetal calf serum for 3 h. Blank medium or gonococcal inocula was added into group A or group B. NO concentration and iNOS mRNA expression at 0, 3, 8 and 12 h were determined by cadmium reduction method and real?time quantitative fluorescent PCR, respectively.Results Compared with group A, iNOS mRNA expression and NO level increased obviously in group B (P<0.01), and NO content peaked at 8 h.Conclusion The gonococcus?induced neutrophil infection model can simulate the micro?oxygen infection circumstance in vivo, and is suitable for studying the pathogenic mechanism of gonococcus.
Key words: gonococcus; neutrophil; nitric oxide
淋球菌为兼性厌氧的革兰阴性双球菌，可引起生殖系统急性化脓性炎症，脓性分泌物中存在大量中性粒细胞[1]。中性粒细胞是一种专职吞噬细胞，感染初期可在炎症介质的介导下聚集在病灶处，通过吞噬摄入致病菌[2]。中性粒细胞杀伤吞噬微生物的机制包括活性氧簇、抗菌蛋白、一氧化氮(NO)等[3]。尽管中性粒细胞在淋球菌感染初期可迅速聚集到病灶，但淋病的迁延不愈表明中性粒细胞引起的炎症反应不足以彻底清除淋球菌。中性粒细胞可杀灭大部分吞噬的细菌(如大肠杆菌)，但部分淋球菌可在中性粒细胞内生存甚至繁殖[4?5]。淋球菌是如何实现免疫逃逸并得以在中性粒细胞内生存的问题目前尚未完全阐明。本研究拟建立中性粒细胞淋球菌感染模型，观察NO和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，旨在将其用于研究淋球菌致病机制。
1 材料与方法
1.1 淋球菌菌株
淋球菌株ST2951用WGC淋球菌专用培养基培养(购自中国科学院武汉生物制品研究所)制备成OD600值为0.15的细菌悬液。
1.2 外周血中性粒细胞的分离
6名健康成年男性分别抽取2 mL肝素抗凝静脉血，取抗凝血与Hank液混匀后小心加入到人中性粒细胞分离液中(天津灏洋生物制品科技有限公司，LTS?1087)，18℃、2000 r/min离心20 min，待离心管由上至下分4层;吸取第3层(中性粒细胞)加入到含Hank液15 mL的试管中，充分混匀，2000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀反复洗涤2次，再用含10%胎牛血清DMEM培养液重新悬浮细胞(1×107/mL);充分混匀后滴入细胞培养板中，置5%CO2培养箱37℃培养3 h备用。取少量细胞液涂片，作台盼蓝拒染实验，鉴定其存活率。
1.3 中性粒细胞淋球菌感染模型的建立
取出培养板，A组每孔加入含10%胎牛血清DMEM 培养液150μL，B组每孔滴入淋球菌悬液150μL;加样完毕后继续孵育，按0、3、8、12 h时间点在培养孔中吸出培养液作相应检测，每组设3个复孔。
1.4 实时荧光定量PCR检测iNOS mRNA含量
用Trizol溶液(美国GIBCO公司)提取中性粒细胞总RNA，经紫外分光光度计检测符合纯度后逆转录为cDNA，再进行实时荧光定量PCR检测。根据GeneBank序列设计iNOS、β?actin引物，序列见表1。反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性5 s，60℃退火10 s，72℃ 延伸20 s，共40个循环。应用SYBR GreenⅠ荧光染料(美国Biotium公司)技术行实时定量PCR反应，获取各组标本的标准曲线，计算机分析Ct值(每个反应管内荧光强度达到系统认为有目的DNA合成时的循环数，以阴性对照作参考)。表1 引物序列
1.5 NO浓度检测
