利用rapd、issr标记分析鄂西柚种质资源遗传多样性.doc
约37页DOC格式手机打开展开
利用rapd、issr标记分析鄂西柚种质资源遗传多样性,利用rapd、issr标记分析鄂西柚种质资源遗传多样性页数37 字数 26806 摘要我国是柑桔的起源中心和遗传变异中心之一，柚的品种资源十分丰富。本研究以分布在鄂西的柚种质资源为对象，利用rapd和issr分子标记对其进行研究，分析鄂西柚品种（类型）的遗传多样性。结果如下:1.对照标准rapd和issr工作分析程序，...
内容介绍
此文档由会员 张阳阳 发布
利用RAPD、ISSR标记分析鄂西柚种质资源遗传多样性
页数 37 字数 26806
摘 要
我国是柑桔的起源中心和遗传变异中心之一，柚的品种资源十分丰富。本研究以分布在鄂西的柚种质资源为对象，利用RAPD和ISSR分子标记对其进行研究，分析鄂西柚品种（类型）的遗传多样性。结果如下:
1. 对照标准RAPD和ISSR工作分析程序，在对鄂西柚种质资源分析时
作一些调整，如DNA提取，PCR反应体系等细节。建立一套适合于分析柚种质资源的RAPD和ISSR反应体系。
2. 从120条RAPD随机引物中筛选出22条在样品间具多态性的10碱基随
机引物，对鄂西柚种资源65份材料进行RAPD分析，扩增共产生207条RAPD标记带，其中多态性带104条，多态性百分率为50.2％；从50条ISSR引物中共筛选出13条在所有样品间均能产生清晰扩增带的ISSR引物，扩增共产生136条ISSR标记带，其中多态性带共82条，多态性百分率为60.3％。检测效果表明，ISSR效果明显高于RAPD。
3. 根据RAPD和ISSR结果聚类分析,表明鄂西柚种资源单株间的遗传差明
显。根据DNA标记数据转化遗传距离矩阵所作UPGMA树系图表明，RAPD聚类结果和ISSR聚类结果均可将所有材料划分为3大类群。 RAPD和ISSR聚类结果相似但不尽相同，分析认为这可能是由于引物检测机制不同而引起的差异。
研究表明，RAPD和ISSR标记技术都能较好的反应各柚类型的遗传差异，适于进行遗传距离相对较近的柚种内各类型间的品系鉴定和遗传相互关系分析。同时文中还就RAPD和ISSR技术方法问题进行了讨论，并对鄂西柚种资源保护提出了一些策略。
关键词
RAPD,ISSR,标记分析,遗传多样性
ABSTRACT
China is one centre of origin, inheritance and variation of citrus. The resources of citrus grandis osbeck contain abundant variations. The genetic diversity of the citrus in western Hubei province was studied based on RAPD and ISSR analyses to these citrus.
1. According to molecular markers of RAPD and ISSR, some modifications have been adjusted to the protocols of evolution of western Hubei citrus germplasm, such as DNA extraction and PCR reaction system, etc. the result is to set up the reaction system of RAPD and ISSR fitting for analyzing evolution of citrus.
2. 10bp twenty-two primers were screened out from 120 random primers and were used to analyze with RAPD among 65 accessions, which generated 207 bands, of which polymorphic bands number was104, the percentage of polymorphism equaled 50.2%;13 primers, which could amplified clearly bands, were screened out from 100 ISSR primers. As a result, 136 bands were generated, of which polymorphic bands number was 82, the percentage of polymorphism was 60.3%. The conclusion indicates that ISSR is more effective than RAPD.
3. According to the clustering analysis of RAPD and ISSR’s results, it proved that there were large inherited differences among all kinds of citrus grandis osbeck resources, Moreover, there are obvious differences among ‘shatian’ pummelos. Two types of ‘shatian’ pummelos, ‘chang shou’ and ‘guang xi’, belong to different groups. It indicates that there are various asexual and sexual variations. The result of RAPD divided all accessions into three groups and ISSR into five. The results of RAPD and ISSR were different but similar. Perhaps it was caused by the different checking systems of primers.
The research proved that RAPD and ISSR molecular markers could show the genetic diversity among all sorts of pummelos well, identify the varieties and analyze the inherited relations each other between the closer inherited distance types. Also it discussed the analyses of technologies as well as systems of RAPD and ISSR, providing some suggestions for the protections of pummelos in western Hubei province.
Key words: pummelo gerplasm RAPD and ISSR inherited diversity
目 录
摘要•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1
ABSTRACT•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••2
1. 前言••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3
柚种质资源研究现状••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3
1.2 DNA分子标记在种质资源研究中的应用••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••6
1.3本实验的研究目的和意义••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••9
2. 材料和方法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••11
2.1 实验材料••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••11
供试柚材料类型•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11
主要仪器设备••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 12
2.1.3 主要试剂••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••12
2.2 实验方法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••14
2.2.1 DNA的提取，纯化及检测•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••14
2.2.2 RAPD反应体系••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••15
2.2.3 ISSR 反应体系•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••16
2.2.4 统计分析方法••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••16
3. 结果与分析•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••17
3.1 DNA提取结果••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••17
3.2 RAPD 最佳反应体系建立•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••18
3.2.1 模板DNA用量••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 18
3.2.2 Mg2+对PCR结果的影响••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
3.2.3 dNTPs对PCR结果的影响•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
3.2.4 PCR热循环的反应参数•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 20
3.3 ISSR 最佳反应体系建立••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 21
3.3.1 模板DNA浓度••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••21
3.3.2 Mg2+对PCR结果的影响•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••22
3.3.3 dNTPs对PCR的影响••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••23
3.3.4 退火温度••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••23
3.4 引物筛选结果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••23
3.5 RAPD和ISSR结果聚类分析••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••25
4. 讨论••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••26
4.1 关于RAPD与ISSR方法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••26
4.2 鄂西柚种质资源的遗传多样性•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••29
4.3 柚种质资源保存建议•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••30
参 考 文 献
[1]. 方德秋，柑橘分类研究的过去，现在及未来，武汉植物学研究，11（4）：375－382
[2]. 方德秋，章文才（1990），利用同工酶进行柑橘起源进化的研究，华中农业大学博士论文.
[3]. 方德秋，章文才，应用同工酶进行宽皮柑橘分类菊及其进化研究，武汉植物学研究，1992，10(4):305-312
[4]. 胡春根（1999），柑桔遗传多样性德分子评价及起源分类研究，华中农业大学博士论文.
[5]. 半田高，柑桔形态性状数量化分类研究，园艺学会杂志，1985，54（2）：145－154
页数 37 字数 26806
摘 要
我国是柑桔的起源中心和遗传变异中心之一，柚的品种资源十分丰富。本研究以分布在鄂西的柚种质资源为对象，利用RAPD和ISSR分子标记对其进行研究，分析鄂西柚品种（类型）的遗传多样性。结果如下:
1. 对照标准RAPD和ISSR工作分析程序，在对鄂西柚种质资源分析时
作一些调整，如DNA提取，PCR反应体系等细节。建立一套适合于分析柚种质资源的RAPD和ISSR反应体系。
2. 从120条RAPD随机引物中筛选出22条在样品间具多态性的10碱基随
机引物，对鄂西柚种资源65份材料进行RAPD分析，扩增共产生207条RAPD标记带，其中多态性带104条，多态性百分率为50.2％；从50条ISSR引物中共筛选出13条在所有样品间均能产生清晰扩增带的ISSR引物，扩增共产生136条ISSR标记带，其中多态性带共82条，多态性百分率为60.3％。检测效果表明，ISSR效果明显高于RAPD。
3. 根据RAPD和ISSR结果聚类分析,表明鄂西柚种资源单株间的遗传差明
显。根据DNA标记数据转化遗传距离矩阵所作UPGMA树系图表明，RAPD聚类结果和ISSR聚类结果均可将所有材料划分为3大类群。 RAPD和ISSR聚类结果相似但不尽相同，分析认为这可能是由于引物检测机制不同而引起的差异。
研究表明，RAPD和ISSR标记技术都能较好的反应各柚类型的遗传差异，适于进行遗传距离相对较近的柚种内各类型间的品系鉴定和遗传相互关系分析。同时文中还就RAPD和ISSR技术方法问题进行了讨论，并对鄂西柚种资源保护提出了一些策略。
关键词
RAPD,ISSR,标记分析,遗传多样性
ABSTRACT
China is one centre of origin, inheritance and variation of citrus. The resources of citrus grandis osbeck contain abundant variations. The genetic diversity of the citrus in western Hubei province was studied based on RAPD and ISSR analyses to these citrus.
1. According to molecular markers of RAPD and ISSR, some modifications have been adjusted to the protocols of evolution of western Hubei citrus germplasm, such as DNA extraction and PCR reaction system, etc. the result is to set up the reaction system of RAPD and ISSR fitting for analyzing evolution of citrus.
2. 10bp twenty-two primers were screened out from 120 random primers and were used to analyze with RAPD among 65 accessions, which generated 207 bands, of which polymorphic bands number was104, the percentage of polymorphism equaled 50.2%;13 primers, which could amplified clearly bands, were screened out from 100 ISSR primers. As a result, 136 bands were generated, of which polymorphic bands number was 82, the percentage of polymorphism was 60.3%. The conclusion indicates that ISSR is more effective than RAPD.
3. According to the clustering analysis of RAPD and ISSR’s results, it proved that there were large inherited differences among all kinds of citrus grandis osbeck resources, Moreover, there are obvious differences among ‘shatian’ pummelos. Two types of ‘shatian’ pummelos, ‘chang shou’ and ‘guang xi’, belong to different groups. It indicates that there are various asexual and sexual variations. The result of RAPD divided all accessions into three groups and ISSR into five. The results of RAPD and ISSR were different but similar. Perhaps it was caused by the different checking systems of primers.
The research proved that RAPD and ISSR molecular markers could show the genetic diversity among all sorts of pummelos well, identify the varieties and analyze the inherited relations each other between the closer inherited distance types. Also it discussed the analyses of technologies as well as systems of RAPD and ISSR, providing some suggestions for the protections of pummelos in western Hubei province.
Key words: pummelo gerplasm RAPD and ISSR inherited diversity
目 录
摘要•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1
ABSTRACT•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••2
1. 前言••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3
柚种质资源研究现状••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3
1.2 DNA分子标记在种质资源研究中的应用••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••6
1.3本实验的研究目的和意义••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••9
2. 材料和方法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••11
2.1 实验材料••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••11
供试柚材料类型•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11
主要仪器设备••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 12
2.1.3 主要试剂••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••12
2.2 实验方法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••14
2.2.1 DNA的提取，纯化及检测•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••14
2.2.2 RAPD反应体系••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••15
2.2.3 ISSR 反应体系•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••16
2.2.4 统计分析方法••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••16
3. 结果与分析•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••17
3.1 DNA提取结果••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••17
3.2 RAPD 最佳反应体系建立•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••18
3.2.1 模板DNA用量••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 18
3.2.2 Mg2+对PCR结果的影响••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
3.2.3 dNTPs对PCR结果的影响•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
3.2.4 PCR热循环的反应参数•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 20
3.3 ISSR 最佳反应体系建立••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 21
3.3.1 模板DNA浓度••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••21
3.3.2 Mg2+对PCR结果的影响•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••22
3.3.3 dNTPs对PCR的影响••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••23
3.3.4 退火温度••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••23
3.4 引物筛选结果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••23
3.5 RAPD和ISSR结果聚类分析••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••25
4. 讨论••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••26
4.1 关于RAPD与ISSR方法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••26
4.2 鄂西柚种质资源的遗传多样性•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••29
4.3 柚种质资源保存建议•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••30
参 考 文 献
[1]. 方德秋，柑橘分类研究的过去，现在及未来，武汉植物学研究，11（4）：375－382
[2]. 方德秋，章文才（1990），利用同工酶进行柑橘起源进化的研究，华中农业大学博士论文.
[3]. 方德秋，章文才，应用同工酶进行宽皮柑橘分类菊及其进化研究，武汉植物学研究，1992，10(4):305-312
[4]. 胡春根（1999），柑桔遗传多样性德分子评价及起源分类研究，华中农业大学博士论文.
[5]. 半田高，柑桔形态性状数量化分类研究，园艺学会杂志，1985，54（2）：145－154
